Efecto de la latrunculina A en la producción de embriones porcinos partenogénicos y clones producidos por “Hand-made cloning”

Fil: Castañeda Alfonso, Flor Katya. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Agronomía. Argentina. La técnica de transferencia nuclear de células somáticas (SCNT) constituye una importante herramienta biotecnológica, teniendo diversas aplicaciones en la producción animal. Sin embargo, además de requerir gran infraestructura, aún sigue siendo ineficiente. Una de las alternativas a la SCNT tradicional es la clonación a mano (del inglés: hand-made cloning, HMC), que ha sido implementada en la presente tesis. En la técnica de HMC, tanto la enucleación como la transferencia nuclear se realizan con lupa estereoscópica y sin micromanipulador ni microscopio invertido. Por lo tanto, esta técnica requiere menos equipamiento que la técnica tradicional y posibilitaría adaptar la clonación a los laboratorios con menor infraestructura. Una de las causas de las bajas tasas de producción de crías viables por transferencia nuclear, es la ocurrencia de pérdidas cromosómicas durante el proceso de activación. Por este motivo, es importante agregar en los protocolos de activación un inhibidor de actina que evite la extrusión del segundo corpúsculo polar (CP), con los cromosomas contenidos en él. Con este objetivo, en la presente tesis se evaluó un sistema alternativo para la producción in vitro de embriones partenogenéticos porcinos diploides, basado en el uso de la latrunculina A (LatA) durante la activación, para luego aplicarlo a los protocolos de clonación. En un primer ensayo, oocitos en metafase II fueron activados mediante un pulso eléctrico, seguido por la incubación en cicloheximida (CHX) combinada con LatA o citocalasina B (CB). Se evaluaron las tasas de extrusión del segundo corpúsculo polar, la formación de dos pronúcleos, el desarrollo embrionario in vitro y la carga cromosómica de cada blastómera del embrión. En base a las elevadas tasas de cigotos que inhibieron el segundo corpúsculo polar y presentaron dos pronúcleos en su interior, y al mayor número de células en los blastocistos partenogénicos producidos empleando LatA, se realizó un segundo experimento en donde se utilizó la LatA para asistir la clonación porcina mediada por la técnica de clonación a mano (HMC). En resumen, nuestros resultados demuestran que el tratamiento con LatA es eficaz para producir embriones partenogénicos diploides, siendo también capaz de inhibir la extrusión del segundo CP y de promover la formación de dos pronúcleos con mayor eficiencia que la CB. Además, la activación con LatA resultó en la producción de blastocistos con mayor número de células y de mejor calidad que la CB. Podemos decir entonces que el uso de LatA durante la activación mejora la eficiencia de la producción in vitro de embriones partenogenéticos porcinos diploides. Por otra parte, esta tesis también demostró que el uso de LatA durante la activación es eficiente para la producción de clones generados por HMC, empleando células somáticas de animales adultos. Por primera vez, esta tesis evaluó la factibilidad de acompañar la activación con LatA en la clonación porcina por la técnica de HMC, produciendo embriones capaces de desarrollar hasta la etapa de blastocisto. Maestría en Producción Animal