La proteína supresora de tumores Retinoblastoma caracterización de su dominio AB y mecanismo de interacción con la oncoproteína E7 del papilomavirus humano = The Retinoblastoma tumor suppressor protein: caracterization of its AB domain and mechanism of interaction with the human papillomavirus E7 oncoprotein

La proteína supresora de tumores retinoblastoma (Rb) es una proteína "hub" o central que juega un rol central en el control del ciclo celular en células eucariotas, y su inactivación funcional se encuentra asociada a la progresión del cáncer en humanos. En particular, la interacción de la proteína HPV-E7 con Rb se encuentra relacionada al poder oncogénico del papilomavirus humano (HPV). El atraso en los estudios estructura-función de Rb se debe en gran medida a la dificultad para la producción recombinante y el estudio en solución de esta proteína o sus dominios. En la presente tesis, nos avocamos al estudio en solución del dominio RbAB humano, que media una gran parte de las funciones de esta proteína incluyendo la interacción con HPV E7. Para ello, desarrollamos un protocolo para su expresión recombinante que permitió obtener rendimientos de 6 mg/litro con una pureza final mayor al 95 por ciento. Estudios biofísicos revelaron que RbAB se encuentra en solución como un monómero plegado a 20© C. RbAB es marginalmente estable a temperatura fisiológica, y estudios de plegamiento sugieren que los sub-dominios RbA y RbB tienen diferente estabilidad en solución. Estos estudios representan el primer análisis sobre las propiedades conformacionales en solución de este dominio. En la segunda parte de la tesis realizamos un análisis termodinámico y cinético de la interacción entre RbAB y HPV16-E7 en solución. Estos estudios revelaron que el 90 por ciento de la energía de interacción es aportado por el motivo lineal de alta afinidad LxCxE, pero que otros sitios secundarios en E7 participan de la interacción con el dominio RbAB, indicando que la misma es de carácter modular. El caracter intrínsecamente desordenado de E7 modula la interacción, y la fosforilación de la región CKII-PEST potencia la afinidad del complejo. Estudios cinéticos revelaron que la unión del motivo LxCxE a RbAB sigue un mecanismo de dos estados, con una asociación rápida y un tiempo de vida en el órden de 20-200 seg. El complejo E7-RbAB se encuentra estabilizado por interacciones de tipo electrostático, que podrían determinar al menos en parte la especificidad de la interacción de las diferentes proteínas E7 de papilomavirus. El estudio mecanístico de las interacciones proteína-proteína es esencial para comprender el funcionamiento de las intrincadas redes de interacción presentes en las células, y la presente tesis aporta información sobre una de estas interacciones, tomando como proteína modelo a una proteína clave para el desarrollo de tumores humanos. Dado que el motivo LxCxE se encuentra conservado en numerosas proteínas virales y celulares que unen a Rb, los estudios presentados sientan las bases para el análisis de los mecanismos que permiten la discriminación de diversas proteínas que compitan por la unión al "surco LxCxE".