Análisis termodinámico de la unión de enalaprilato a la enzima confersora de angiotensina I de pulmón de cerdo

La enzima conversora de angiotensina I (ECA) es una dipeptidil carboxipeptidasa que cataliza la conversión de angiotensina I en el octapéptido vasopresor angiotensina II e inactiva el nonapéptido vasodilatador bradiquinina.El reconocimiento del papel de esta enzima en la regulación de la presión sanguínea ha estimulado el interés en encontrar inhibidores de ECA para su uso como agentes antihipertensivos. En esta memoria se describe un método en dos pasos de cromatografía de afinidad para purificar ECA de pulmón de cerdo utilizando para ello Concanavalina A Sepharosa 4B y cromatografía de afinidad en Sepharosa 6B acoplada a lisinoprilo. El mismo esquema de purificación se ha utilizado para la obtención de ECA-Cobalto, donde el ión zinc localizado en el sitio activo de la enzima se reemplaza por cobalto. El espectro visible de ECA-Cobalto muestra una banda ancha característica de 500 a 600 nm. La forma y el máximo de absorción de este pico cambia en presencia de inhibidores de ECA que se unen al sitio catalítico. Se ha determinado el valor del coeficiente de extinción molar de la enzima utilizando el método de Gill y Von Hippel (ε280=2.18⋅105M-1cm-1) y la masa molecular por electroforesis en condiciones desnaturalizantes (170kDa). Se ha realizado un estudio de la estabilidad de la enzima en función de la temperatura y en presencia de diferentes inhibidores. Se han medido los parámetros cinéticos de ECA-Cobalto y ECA-Zinc. ECA-Zinc muestra un valor ligeramente mayor de kcat que ECA-Cobalto, que resulta en un aumento de la eficiencia para hidrolizar FAPGG. Con el fin de determinar y cuantificar las fuerzas que conducen a la asociación de los inhibidores con ECA se ha estudiado la energética de la unión de enalaprilato, lisinoprilo y captoprilo a la enzima en función de la temperatura y el pH mediante calorimetría isotérmica de valoración (ITC). La caracterización de la unión se llevó a cabo en diferentes tampones con diferentes calores de ionización para determinar el número de protones intercambiados en el proceso. Para enalaprilato se ha determinado el número de protones intercambiados en el intervalo de pH de 6 a 8. Para determinar las constantes de unión utilizando ITC se ha empleado el método de desplazamiento propuesto por Sigurskjold que consiste en titular una muestra de la enzima unida a un inhibidor débil, con una disolución de un inhibidor fuerte, que desplaza al débil de su unión a la macromolécula. Con esta información se han determinado todos los parámetros termodinámicos en el proceso de unión de los inhibidores a ECA.